AMPK激活劑：生理活性和作用的機制

摘要

    AMP活化蛋白激酶（AMPK）是能量穩態的中樞調節器，其協調代謝途徑，並因此平衡營養供應與能量需求。由於AMPK活化對代謝有利的生理學結果，AMPK已被認為是控制人類疾病，包括代謝綜合徵候群和癌症的重要治療靶標。因此，AMPK的激活劑可能具有作為這些疾病的新治療劑的潛力。在這次的回顧，本文提供間接和直接AMPK激活劑及其作用模式，與AMPK的結構相關的全面總結。本文討論異構體特異性AMPK複合物之間的功能差異，及其對新型AMPK激活劑的發展，以及在治療人類疾病中結合不同AMPK激活劑的潛力的重要性。

一、前言

作為細胞能量傳感器，AMP激活的蛋白激酶（AMPK）響應於多種條件而被激活，所述條件耗盡細胞能量水平，例如營養飢餓（特別是葡萄糖），缺氧和暴露於抑制粒線體呼吸鏈複合物的毒素。AMPK是由催化α-亞基（α1和α2），支架β亞基（β1和β2）和調節性γ亞基（γ1，γ2和γ3;圖1）所組成的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶複合物。AMPKα1-，β1-和γ1-亞基在許多組織中普遍表達，使得α1β1γ1複合物成為AMPK測定來鑑定AMPK激活劑的參考。不過，考慮到獨特的AMPK複合物的獨特功能和/或亞細胞（或組織）特異性分佈，參考篩選α 1β1 的γ1複合物可能呈現有限範圍的AMPK生理學。根據這個概念，越來越多的證據表明，失活突變和特定同種型的遺傳刪除產生組織特異性生理結果。經常在人類心肌病中觀察到AMPKγ2亞基中的突變，並且AMPKα2亞基的缺失但不是α1，已經在小鼠模型中顯示減少中風的梗死體積。

圖 1、AMP激活蛋白激酶（AMPK）亞基的功能域。哺乳動物α 1 / α 2和β1 / β2亞型非常相似，並且它們的特徵被示出。AMPK α亞基：KD，含有Thr-172的激酶結構域，用於通過上游激酶的活化; AID，自身抑制性結構域; 2個 α -RIM，調節亞基相互作用基序，觸發響應於AMP結合到AMPKγ亞基的構象變化; α -CTD，C-末端結構域與β-亞基的結合。AMPKβ亞基：CBM，碳水化合物結合模塊，其中Ser108對於某些直接AMPK激活劑如噻吩並吡啶酮（A-769662）和水楊酸鹽(salicylate)的作用是重要的; β-CTD，包含α亞基結合位點的C-末端結構域，緊接著是γ-亞基相互作用的結構域。AMPK γ亞基：三個γ亞基同種型具有可變的N-末端結構域（NTD）; 四個CBS，胱硫醚-β-合酶結構域，其形成兩個Bateman結構域，其產生四個腺苷核苷酸結合位點（位點1-4）。位點2似乎總是空的，位點4具有緊密結合的AMP，而位點1和3代表在競爭中結合AMP，ADP或ATP的調節位點。

1.1 AMP的變構激活AMPK

第一類直接AMPK激活劑是模擬細胞AMP的小分子。這些分子觸發AMPK複合物中的構象變化，其允許通過AMPKα亞基中Thr-172的磷酸化進一步激活。通過AMP結合的AMPK變構活化的分子機制，已經通過幾個最近的AMPK的三維結構的研究證明。這種晶體結構已經顯示，在AMPKγ亞基內的胱硫醚-β-合酶結構域重複，在AMPK響應於細胞腺苷核苷酸（AMP，ADP或ATP）被激活的分子機制中的重要性。AMPKγ亞基中的四個連續的胱硫醚-β-合酶結構域，提供四個潛在的腺嘌呤核苷酸結合位點。根據攜帶參與配體結合的保守天冬氨酸殘基的胱硫醚-β-合酶結構域重複的數目，這些位點編號為位點1-4。在哺乳動物AMPK γ1亞基，位點2似乎總是空的，並且站點4有一個緊密結合的AMP分子，而站點1和3表示了結合AMP，ADP或ATP的調節位點，其競爭結合。AMP與位點1的結合似乎引起別構激活，而AMP或ADP與位點3的結合似乎調節Thr172的磷酸化狀態。雖然細胞ADP水平高於AMP，最近的一項研究表明AMP是真正的激活劑，增強體內LKB1依賴性Thr 172磷酸化。AMP與AMPKγ亞基的結合，作為激活AMPK複合物的構象開關的重要調節特徵。催化AMPK α亞基含有N末端激酶結構域（KD）緊跟一個自抑制結構域（AID）。三維結構顯示AID與KD的小葉和大葉相互作用，並導致AMPK維持在非活性構象。一旦AMP結合到AMPK γ亞基，KD / AID和AMPKα亞基的球狀C-末端結構域之間的α-RIM（調節亞基相互作用基序），以類似方式與AMPKγ亞基上的一個調節腺苷核苷酸相互作用到圍繞腺苷的兩個臂。這些構象變化釋放和暴露AMPKα的KD從其AID以活化AMPK複合物。

1.2 通過上游激酶調節AMPK活性

生理AMPK的激活涉及Thr-172在KD的激活環內的磷酸化，在AMPKα催化亞基。兩種上游激酶，LKB1和CaMKKβ（Ca^2 + /鈣調蛋白依賴性蛋白激酶β）已被廣泛記錄以磷酸化AMPKα亞基的Thr-172。值得注意的是，有一些證據表明，Thr172上的LKB1依賴性AMPKα磷酸化，由於AMP與AMPKγ-亞基的結合而大大增強，同時，AMP結合抑制這種由蛋白磷酸酶，例如PP2A和PP2C在體外的活化磷酸化的脫磷酸化。有趣的是，AMP對Thr172磷酸化的AMPKα亞基的影響，似乎依賴於β-亞基的N-末端荳蔻醯化，雖然潛在的機制仍有待證明。與LKB1複合物相反，另一上游AMPK激酶CaMKKβ，可以響應於細胞Ca ^2 +的增加而活化AMPK，而沒有ATP / ADP / AMP水平的任何顯著變化。消耗細胞ATP的治療不能有效激活LKB1陰性腫瘤中的AMPK，因為CaMKKβ的基礎活性太低而不影響AMPKαThr172的磷酸化狀態，儘管由於ATP消耗引起的AMP的增加使得AMPKα-亞基更好的受質為CaMKKβ。然而，這些治療方法可以在升高細胞內Ca^2 +的條件下引起AMPK活化。這些數據表明，在AMPKα-亞基上的Thr-172處的磷酸化/去磷酸化平衡，涉及AMP結合AMPKγ亞基和AMPKβ-亞基的N末端修飾，為AMPK激活機制增加了另一個水平的複雜性。

1.3 AMPK的生理功能

    正如其名稱所示，AMPK在維持代謝應激的細胞內穩態的合成代謝和分解代謝程序之間的平衡中具有關鍵作用。由於AMPK在葡萄糖/脂質體內穩態、體重，食物攝取、胰島素信號傳導和粒線體生物發生中的功能特性，AMPK被認為是治療包括2型糖尿病和肥胖的代謝疾病的主要治療靶標。

    許多研究揭示了AMPK在腫瘤發生中的作用。連接AMPK與癌症生物學的初步報告描述了，作為主要AMPK上游激酶的腫瘤抑制基因LKB1的發現。LKB1基因的遺傳突變負責遺傳的Peutz-Jeghers綜合徵，其特徵在於在腸中發生錯構瘤性息肉。從那以後，許多體外和體內研究表明AMPK確實介導LKB1的腫瘤抑制作用。這得到了能夠激活AMPK（二甲雙胍，苯乙雙胍，A-769662）的藥物，延遲體內模型中的腫瘤發生的發現的發現的支持。已經作出了許多努力，來了解AMPK的抗腫瘤發生功能的基礎的分子機制。這些研究表明，mTORC1和RNA聚合酶I轉錄因子TIF-1A，這兩者都是快速增殖細胞所需的，是在AMPK的控制之下。此外，已經顯示AMPK活化導致G1細胞週期停滯，其與p53的活化相關，隨後誘導細胞週期抑制蛋白p21。同樣，已經顯示AMPK通過誘導細胞週期蛋白依賴性激酶抑制劑p27kip1，響應於代謝應激的磷酸化和伴隨的穩定化而引起細胞週期停滯。最近的一項研究描述了p53-AMPK-mTORC1調節，通過p53複製基因產物Sestrin1 / 2的附加層。然而，應當注意，一旦腫瘤建立，AMPK可以保護腫瘤細胞免受細胞毒性劑、營養限制和缺氧的作用。因此，AMPK激活劑可能在癌症的治療中是有害的。

    AMPK生物學的另一個重要方面是AMPK在自噬中的作用，這是一種維持細胞內穩態的溶酶體依賴性分解代碼程序。多項研究表明，AMPK在自噬調節中具有重要作用，通過直接磷酸化兩種自噬啟動調節劑：蛋白激酶複合物ULK1（Unc-51-樣自噬激活激酶）和脂質激酶複合PI3KC3 / VPS34（磷脂醯肌醇3-激酶，催化亞基型3;也稱為VPS34）。許多報告已經證明自噬在糖原分解（glycophagy）和脂肪分解（lipophagy）中的代謝意義，甚至在調節脂肪質量以及體內分化中的代謝意義。在這方面，闡明AMPK和自噬之間的分子連接將提供一種新的途徑，以擴大的AMPK在細胞內環境穩定，包括代謝功能網絡。

    鑑於這些功能屬性，如圖2所總結的，已經進行了許多努力來開發強力的AMPK測定並鑑定AMPK調節劑以提供用於多種人類疾病的治療。在這次審查中，本文提出了間接和直接AMPK激活劑，及其作用模式與AMPK的結構相關的全面總結，並討論AMPK作為治療目標的影響。

圖 2、AMP活化蛋白激酶（AMPK）生理作用的概述。

二、間接AMPK激活劑

    實際上，AMPK可被引起AMP或鈣積聚的任何調節劑活化。這些被分類為間接活化劑，因為AMPK和調節劑之間的直接相互作用不是必需的。間接AMPK激活列於表1。

表 1、間接AMPK激活劑。

2.1 雙胍(Biguanides)

    二甲雙胍(Metformin)是一種雙胍(biguanide)，一種胍(guanide)的合成衍生物，它是從植物山羊豆(Galega officinalis)的天然產物，並已被用作第一線抗糖尿病藥物，因為它能夠減少肝臟葡萄糖生產和提高外週胰島素敏感性的能力。許多研究已經證明二甲雙胍的作用歸因於AMPK。周(Zhou)等人已經揭示了AMPK介導二甲雙胍的抗糖尿病作用的分子機制：刺激脂肪酸氧化和葡萄糖攝取，以及脂肪生成基因和肝葡萄糖產生的下調。二甲雙胍的AMPK激活不是直接激活的結果；相反，二甲雙胍抑制粒線體呼吸鏈的複合物I，導致AMP：ATP比例增加。這種間接的機制，進一步得到了觀察的支持: 二甲雙胍無法激活AMPK，在表達AMP不敏感（R531G）AMPKγ2亞基的細胞中。Fullerton等人的最新發現還顯示，AMPK的乙醯輔酶A羧化酶的磷酸化，是二甲雙胍的降脂作用和胰島素敏化作用所需的，從而支持AMPK在二甲雙胍作用中的作用。然而，最近的工作表明，AMPK的作用已被質疑，二甲雙胍在肝特異性AMPKα敲除或LKB1敲除的動物模型中降低血糖水平。因此，需要進一步的研究，來區分二甲雙胍的AMPK依賴性和非依賴性的效果。

2.2 噻唑烷二酮(TZDs)

噻唑烷二酮（TZD），也稱為格列酮類(glitazones)，是一類胰島素敏化藥物，包括曲格列酮(troglitazone)，吡格列酮(pioglitazone)和羅格列酮(rosiglitazone)。TZDs主要通過激活核激素受體過氧化物酶體增殖物激活受體（PPAR），特別是PPARγ，其親和力最高。它們也已知通過AMPK活化，部分地發揮其抗糖尿病作用。TZD在多種組織中迅速激活AMPK，包括骨骼肌肝臟和脂肪組織中，且激活機制與抑制粒線體呼吸鏈的複合物I的AMP的積累相關。此外，TZD處理誘導脂肪細胞中脂聯素(adiponectin)的表達和釋放，從而激活骨骼肌和肝臟中的AMPK，導致葡萄糖攝取和脂肪酸氧化增加，以及肝臟葡萄糖生成減少。因此，AMPK可以被TZD激活，通過至少兩種不同的機制。

2.3 多酚(polyphenols)

    除了藥劑，許多天然存在的化合物和植物化學物質，已經顯示活化AMPK。其中有多酚(polyphenols)，一種結構類型的天然或合成產品，其特徵在於存在多個酚結構單元。儘管結構變化，許多多酚能夠激活AMPK，並且它們對2型糖尿病和代謝綜合徵候群發揮有益作用。這些包括來自紅葡萄的白藜蘆醇(resveratrol)，從許多植物單位，包括水果、蔬菜和穀物的槲皮素(quercetin)，在一些植物如大豆，發現染料木素(genistein)，來自綠茶的表沒食子兒茶素沒食子酸酯(epigallocatechin gallate，EGCG)，來自黃連（Coptis chinensis）的小蘗鹼(berberine)以及來自薑黃(Curcuma longa)的薑黃素(curcumim)。這些化合物激活AMPK的機制，似乎需要AMP水平的升高，因為已知許多這些化合物抑制粒線體ATP的產生。白藜蘆醇，槲皮素，兒茶素-3-沒食子酸酯(epigallocatechin-3-gallate)和薑黃素靶向和抑制粒線體˚F ₁ ˚F ₀ -ATPase / ATP合酶，而小蘗鹼與呼吸鏈複合物I的抑制相關。白藜蘆醇，小蘗鹼和槲皮素的AMPK活化的分子機制，已經進一步得到支持，通過觀察這些化合物不能激活AMPK，在表達AMP不敏感（R531G）AMPKγ2亞基的細胞中。

2.4 人參皂苷(Ginsenoside)

    人參(Panax ginseng)已長期以來，已知在2型糖尿病和代謝綜合徵候群中具有有利的作用。人參皂苷(Ginsenosides)，一類四環三萜糖苷(tetracyclic triterpene glycosides)，是人參中主要的藥理成分。迄今為止，已經從植物屬Panax中分離了超過80種結構不同的人參皂苷，並且若干人參皂苷，包括Rb1，Rb2，Rc，Re，Rg1，Rg2和Rg3，已被報導活化AMPK，導致葡萄糖攝取增加，肝甘油三酯和膽固醇水平降低，以及抑制脂肪生成和肝葡萄糖產生。人參皂苷的AMPK激活機制在很大程度上是未知的；然而，據推測這些化合物可能通過AMP依賴性機制活化AMPK，因為人參皂苷Rb1已被報導增加細胞內AMP：ATP比例。

2.5 α硫辛酸(α-Lipoic acid)

    α硫辛酸（ALA）是來自辛酸(octanoic acid)的天然存在的二硫醇(dithiol)化合物，通過作為丙酮酸脫氫酶(pyruvate dehydrogenase)和α-酮戊二酸脫氫酶(α-ketoglutarate dehydrogenase)的輔因子，而在線粒體生物能量反應中具有關鍵作用。由於其強大的抗氧化性能，ALA在用於治療糖尿病併發症中獲得了極大的關注。最近的研究還證明，ALA通過在各種組織中激活AMPK，對代謝綜合徵候群，脂毒性心肌病和內皮功能障礙產生有益效果。儘管ALA對AMPK調節的基礎機制知之甚少，Shen等人已報導ALA增加C2C12肌管的細胞內鈣水平，表明CaMKK，但不是LKB1，負責AMPK激活。在下丘腦中，其中AMPK參與調節食慾，ALA抑制AMPK活性，導致食物攝取減少。需要進一步檢查以了解ALA調節AMPK的分子機制。

2.6 其他AMPK調節劑

    儘管細胞內能量水平是AMPK活性的主要決定因素，AMPK對細胞活性氧（ROS）的水平高度敏感。在許多情況下，氧化應激導致細胞內ATP消耗。然而，最近的研究表明，ROS可以刺激AMPK活性，即使沒有減少細胞ATP。AMPKα亞基的氧化修飾，似乎是在氧化應激條件下激活AMPK的主要機制。因此，任何能夠誘導細胞內ROS產生的調節劑，可以激活AMPK而沒有相關聯的ATP水平的降低。這樣的調節劑是來自丹參(Salvia miltiorrhiza Bunge)的隱丹參酮(cryptotanshinone)，其發揮抗糖尿病作用和抗癌作用，通過ROS依賴AMPK的活化。DNA損傷劑，如順鉑(cisplatin)或金屬，包括砷(arsenite)，釩(vanadate)和鈷(cobalt)，通過ROS產生激活AMPK。

三、直接AMPK激活劑

    幾種AMPK激活劑直接結合併激活AMPK，而細胞ATP，ADP或AMP水平沒有任何顯著變化。相反，這些激活劑誘導AMPK複合物中的構象變化，導致激活，可能通過與AMPK的特定亞基的直接相互作用（表2）。Abbott實驗室在2006年的A-769662的鑑定，通過證明用非核苷酸配體的AMPK活化是可能的，提供了對於直接AMPK激活劑的發展的新見解。此外，它開放了開發具有AMPK異源三聚體特異性的激活劑的可能性。從那時起，許多報告直接AMPK激活劑的研究，提供了關於同種型特異性調節劑的有意義的進展。

表2、直接AMPK激活劑

3.1 5-氨基咪唑-4-甲醯胺核苷(5-Aminoimidazole-4-carboxamide riboside，AICAR)

    第一種直接AMPK激活劑5-氨基咪唑-4-甲醯胺核苷（AICAR），是通過腺苷轉運蛋白攝入細胞，並被腺苷激酶磷酸化的腺苷類似物，從而產生AMP模擬的AICAR單磷酸（ZMP）。與細胞AMP相似，ZMP結合到AMPKγ亞基上的位點3。ZMP不改變ADP：ATP比率或改變氧攝取，其通過抑制粒線體功能與許多AMPK激活劑發生。儘管在無細胞系統中ZMP是比AMP低得多的AMPK激活劑，但是AICAR在大多數細胞中直接激活AMPK，因為ZMP可以在細胞中累積至毫摩爾濃度。ZMP是嘌呤核苷酸合成途徑中的天然中間體，並且由AICAR轉化酶代謝，其催化嘌呤核苷酸肌苷酸的合成。因此，AICAR的作用似乎在靜止的原代細胞中，比在快速增殖的細胞中更明顯。與這個概念一致，抑制AICAR轉化酶的抗癌劑，例如甲氨蝶呤(methotrexate)和培美曲塞(Pemetrexed)，使腫瘤細胞對AICAR的AMPK激活和生長抑制作用敏感。這些結果表明，AMPK參與抗葉酸藥物治療癌症的化療效果。然而，應當注意，作為AMP類似物，AICAR能夠激活許多其它AMP依賴性酶，例如果糖-1,6-二磷酸酶。

3.2 噻吩並吡啶酮（A-769662）和苯並咪唑（化合物911）衍生物

    Abbott實驗室已經開發了噻吩並吡啶酮化合物A-769662，其在無細胞測定中引起純化的AMPK的變構活化。這種化合物顯示許多預期與體內AMPK活化（正常大鼠中脂肪氧化的增加；肥胖小鼠體重，血漿葡萄糖/甘油三酯和肝甘油三酯的減少）相關的代謝效應。與AICAR不同，A-769662顯示出對AMPK的高特異性。A-769662，類似AMP，變構激活AMPK複合物，並抑制AMPKα亞基中Thr-172的去磷酸化。不過，A-769662似乎使用不同的分子機制來活化AMPK。值得注意的是，它在AMPKα亞基上變構性地激活AMPK而沒有Thr172磷酸化，這是AMP依賴性AMPK激活所絕對需要的。重要的是，它需要磷酸化AMPKβ1亞基上的Ser108。 此外，已經在體外和體內觀察到AMP和A-769662的強協同AMPK活化，清楚地表明A-769662和AMP在AMPK複合物和不同的活化機制上具有不同的結合位點。另一種直接的AMPK激活劑，化合物911，最近已被鑑定。已報導911在變構性激活AMPK中和防止脫磷酸化方面比A-769662有效5-10倍。與A-769662類似，991不活化含有AMPKβ亞基的Ser108突變的AMPK複合物，表明這兩種AMPK調節劑共享AMPK活化的相似分子機制。Xiao B等人，已經在A-769662或991存在下解析了全長人AMPK複合物的晶體結構。在該結構中，A-769662和911位於AMPKα的KD之間的位點亞基和β-亞基的碳水化合物結合模塊（CBM），該位點不同於AMPKγ亞基上的腺嘌呤核苷酸結合位點。有趣的是，兩種化學物都表現出對含有β1，而不是β2同種型的AMPK複合物的特異性。

3.3 水楊酸鹽（Asprin的前體藥物）

    水楊酸鹽是傳統上從柳樹皮中提取的天然化合物。水楊酸乙酯（阿司匹林）是比水楊酸更容易口服的衍生物，並且在進入循環時迅速分解成水楊酸鹽。儘管環加氧酶（COX1和COX2）是阿司匹林的確立靶標，但最近報導水楊酸鹽（儘管不是阿司匹林）是AMPK的直接活化劑。根據其與A-769662的結構相似性，水楊酸似乎結合在與A-769662靶向的位點重疊的位點。兩種化合物引起變構活化，水楊酸鹽拮抗A-769662的作用。此外，兩種化合物的作用，高度依賴於AMPKβ1亞基，但不依賴於AMPKβ2。兩種化合物與AMPKβ1亞基的Ser108突變都不會活化AMPK複合物。考慮到噻吩並吡啶酮（A-769662），苯並咪唑（化合物911）和水楊酸酯衍生物，通過不同於大多數AMP-模擬物或ATP-消耗性AMPK激活劑的機制激活AMPK，這些分子與間接AMPK激活劑的組合，預期增強AMPK對病理生理狀況的效應，例如代謝紊亂和癌症。

3.4 化合物-13

    最近對包含1,200個AMP模擬物的化學文庫的篩選，鑑定了5-（5-羥基 - 異噁唑-3-基） - 呋喃-2-膦酸，稱為化合物-2（C-2），及其前藥C- 13，作為AMPK的有效變構活化劑。隨後的研究已經證明了C-2模擬AMP刺激AMPK的作用的分子機制。如AICAR觀察到的一個關注是C-2可能影響除AMPK（PFK1，FBP1和糖原磷酸化酶）之外的AMP調節的酶的可能性。然而，C-2不影響任何這些酶或幾種使用AMP作為受質的酶。使用幾種AMPK複合物的體外無細胞測定顯示C-2是AMPK的有效變構激活劑（EC 50為10-30nM）。事實上，據報導C-2比A769662的效力> 20倍，並且比AMP更有效兩個數量級以上。另外，C-2和C-13不誘導在腺嘌呤核苷酸水平的任何顯著變化。雖然確切的C-2結合位點尚未確定，Hunter等人提出的證據建議，C-2與AMP競爭結合AMPKγ亞基。令人驚訝的是，AMPK激活劑C-2和C-13對AMPKα1亞基表現出同種型特異性。AMPK複合物的結構分析表明在用於產生AMPKα同種型特異性抗體的α調節亞基，相互作用基序-2（α-RIM2）區域中的AMPKα1和α2亞基的不同序列，導致C-2與一面的獨特相互作用在γ亞基的位點3結合的AMP，說明C-2對AMPKα同種型的選擇性。C-2 / C-13的鑑定，代表了不同於顯示CBM依賴性AMPKβ亞基特異性的A-769662的直接和同種型特異性AMPK調節劑的開發的實例。

3.5 PT-1

    另一種小分子激活劑AMPK，PT-1，最初通過篩選激活僅包含KD和AID的截短的AMPKα1構建體的化合物篩選。。PT-1激活完整的AMPKα1β1γ1以及AMPKα1KD-AID構建體，但不激活AMPKα1KD構建體，表明PT-1直接結合KD和AID之間的裂口，從而緩解自身抑制。與來自無細胞激酶測定的結果一致，已經顯示PT-1在L6肌管中在Ser79（一種良好表徵的AMPK受質）上增加ACC的磷酸化，而在細胞AMP：ATP比率中沒有任何顯著變化。然而，該結果受到Jensen等人最近的報告的質疑，表明PT-1通過粒線體呼吸鏈複合物的抑制間接激活AMPK，從而增加細胞AMP：ATP和/或ADP：ATP比例，而不是直接與AMPKα1亞基結合，如先前所建議的。與PT-1增加細胞內AMP水平的概念一致，PT-1在表達AMP不敏感的AMPKγ1R299G突變體的HEK293細胞中不激活AMPK，表明PT-1作為間接激活劑。此外，這項研究表明PT-1選擇性激活包含γ1-亞基，而不是γ3孵化的小鼠肌肉中的AMPK複合物。作者提出PT-1在肌肉中激活含有γ3的複合物的失敗不是這種複合物的固有特徵，而是因為PT-1不增加含有γ3-複合物的不同亞細胞區室中的細胞AMP：ATP比例。因此，應進一步研究PT-1作用的分子細節以解決由這些矛盾結果提出的問題。

3.6 MT 63-78（Debio0930）

    另一種AMPK直接調節劑，MT 63-78（Debio0930），最近已被鑑定為變構激活AMPK。生化分析顯示，MT 68-78對含有AMPKβ1亞基的AMPK複合物具有高度選擇性，如A-769662和水楊酸酯所見。值得注意的是，MT 63-78強烈抑制前列腺癌細胞系的生長，伴隨著AMPK的伴隨活化，但細胞ATP，ADP和AMP水平沒有任何顯著變化。重要的是，MT 63-78對前列腺癌的生長抑製作用比A-769662的抑制作用高至少10-40倍。在許多前列腺癌模型中，雄激素被認為驅動癌症的腫瘤發生和進展。因此，雄激素剝奪治療是治療這種癌症的第一選擇。然而，在許多情況下，雄激素 - 信號傳導級聯在靶向雄激素受體的化學治療（例如雄激素受體拮抗劑MDV3 100）後被重新激活。前列腺癌中由雄激素引起的新生脂肪生成的上調也與癌症發展密切相關。上調從頭受雄激素在前列腺癌脂肪生成也密切相關的癌症的發展。考慮到AMPK負調節從頭脂肪合成，AMPK激活劑和雄激素受體抑制劑的組合治療，可以協同作為抗前列腺癌藥物。這一概念的臨床潛力已經在治療試驗中顯示。這項試驗表明，從頭脂肪生成的抑制是AMPK抑制生長的關鍵機制，MT 63-78增強雄激素受體拮抗劑（MDV3100）對前列腺癌細胞生長的抑制作用。此外，MT63-78對生長的抑製作用不限於前列腺癌細胞，並且也已在LKB1無效A549細胞和B-RAF突變（V600E）KTC-1細胞中觀察到。這些結果表明MT 63-78減緩了廣譜癌症的生長，從而增加了目前抗癌藥物的化療效果。

四、透視

    在生理學試驗中已經顯示活化AMPK的大多數現有試劑，例如二甲雙胍(metformin)，TZDs和2-脫氧葡萄糖(2-deoxyglucose)，是抑制氧化磷酸化和糖酵解的間接活化劑，從而增加ADP（AMP）:ATP比例。然而，並不總是清楚這些藥物的作用是否由AMPK介導。在這個意義上，許多努力集中在證明AMPK激活劑的分子機制和驗證許多人類疾病所產生的生理學。在開發AMPK激活劑時的另一個問題是同工型特異性AMPK複合物之間存在功能差異。例如，AMPKα2β2γ3複合物主要通過在骨骼肌中的運動而被激活，⁵因此特異性靶向AMPKα2β2γ3。最近報告直接AMPK激活劑的研究已經提供了發展異構體特異性調節劑的有意義的進展。對於AMPKα亞基，C-2（或前藥C-13）對含有AMPKα1亞基的AMPK複合物具有優先性。類似於A-769662，，包括911，水楊酸（阿司匹林的前藥）和MT 68-78的幾種化合物特異性活化含有AMPKβ1的複合物，但不是含有AMPKβ2的複合物。在AMPKγ亞基的情況下，儘管需要在細胞水平進行進一步研究，但體外生物化學數據顯示PT-1對攜帶AMPKγ1亞基的AMPK複合物具有特異性。除了這些活化劑，許多製藥公司已經提出了新的AMPK活化劑的專利申請，其在結構上與AMP無關。來自每個製藥公司的一些代表性化合物列於表3中。專利文獻中的AMPK激活劑的綜合列表在別處可獲得。非非常令人感興趣的是，儘管他們聲稱是新的，但是表3中列出的大多數直接AMPK活化劑，顯示與A-769662的原始噻吩並吡啶酮核心結構非常相似，除了烯烴羥吲哚衍生物由F. Hoffmann-La Roche AG報告。鑑於最近的報告表明A-769662。AMPK獨立效應，需要進一步的研究來澄清積累數量的直接AMPK激活劑的分子基礎，通過比較它們的激活機制和通過分析它們在AMPK複合物組合中的選擇性分佈。

表 3、來自專利文獻的直接AMPK激活劑

    通過臨床前研究揭示的AMPK激活劑的一個有趣方面是，不同AMPK激活劑的組合的增強的治療效果。由於脂肪合成途徑的主要調節，AMPK可能是另外的化療目標，因為脂肪酸合成的上調是多種癌症的標誌。有證據表明，阿司匹林（水楊酸）和二甲雙胍的組合有效地減少前列腺癌和肺癌細胞的克隆生存。與該發現一致，將脂肪酸和/或膽固醇加入培養基中逆轉水楊酸鹽和二甲雙胍對細胞存活的抑制作用，表明從頭脂肪生成的抑制是重要的。類似地，直接AMPK激活劑可以開啟用於抗化療劑的新的治療途徑。 在常規間接AMPK激活劑的情況下，作用機制需要上游激酶LKB1用於生理學AMPK激活。因此，間接AMPK激活劑作為抗癌藥物的潛力限於LKB1缺陷型腫瘤，特別是對於非小細胞肺癌，其中超過30％具有LKB1失活突變。在這方面，直接AMPK激活劑可以克服這種限制。證據表明，對AMPK激活劑MT 63-78的生長抑制反應不受上游AMPK活化激酶LKB1的狀態的影響。

    總之，最近的標識直接AMPK激活的進步使AMPK一個“成藥”(druggable)的目標對許多人類疾病，雖然需要進一步的研究，以了解AMPK調節其獨特和多樣的下游目標產生生理結果的分子機制。