超越能量穩態：AMP活化蛋白激酶在調節代謝中的擴展作用

摘要

最近在對能量傳感器AMP-活化蛋白激酶（AMPK）調節的理解的令人興奮的進展，再加上對其在維持細胞功能中的重要性的重視，在2014年9月的一次FASEB贊助的會議上聚集了領先的科學家。在本文，報告了這次會議的一些亮點。

一、前言

    AMP活化蛋白激酶（AMPK）是細胞能量狀態的傳感器，其指導代謝適應以支持細胞生長和存活。AMPK由細胞AMP：ATP和ADP：ATP比例的變化激活，並且通過在打開產生ATP的分解代謝途徑時，關閉消耗ATP的生物合成途徑來恢復能量穩態。在過去的20年中，AMPK領域已經大大增長，從幾十篇論文到每年出版的超過1000篇。該領域已經從一組10-12名的研究者成長，對20世紀90年代AMPK的生物學行為感興趣，到全世界數百名研究這種途徑的研究者。實際上，最近的研究已經擴展了AMPK作為代謝傳感器的範例，並且擴展了AMPK對細胞功能具有廣泛影響的更全球化的概念，提供了能量代謝研究與癌症和免疫學等其他科學領域之間的協同作用。AMPK的下游作用調節細胞代謝，細胞生長，細胞器調節（包括線粒體生物發生，自噬，氧化應激和細胞極性）中的許多步驟。因此，AMPK是開發旨在預防和/或治療代謝疾病和癌症的藥物的有吸引力的靶標。

二、解釋AMPK調節的複雜性

    AMPK是由包含典型Ser / Thr激酶結構域的一個催化α亞基，含有碳水化合物結合模塊（CBM）的一個支架β亞基，和含有四個胱硫醚-β-合酶（CBS）結構域的一個調節性γ亞基組成的異三聚體複合物，用於結合腺嘌呤核苷酸。AMPK激活的機制涉及兩個步驟，即在α亞基的激活環內的保守殘基（大鼠催化亞基序列中的Thr172）的可逆磷酸化，以及在γ結構域的CBS結構域內AMP結合時的刺激變構效應亞基。此外，AMP和ADP結合由上游激酶，肝激酶B1（LKB1）和Ca^{2 +} /鈣調蛋白依賴性蛋白激酶β（CaMKKβ）促進Thr172磷酸化，以及通過保護Thr172不被磷酸酶脫磷酸化來調節AMPK。AMP的所有這些效應通過ATP的結合而拮抗，為細胞能量應激條件下AMPK的活化提供非常靈敏的機制。

    Grahame Hardie（鄧迪大學）回顧了目前關於通過能量應激調節AMPK的“規範”機制的知識，並提出了替代的“非規範”機制，包括CaMKKβ的激活和Akt和其他激酶的抑制。最近的研究表明，α亞基內富含絲氨酸/蘇氨酸插入（ST環）的磷酸化，通過阻斷上游激酶LKB1或CaMKKβ到Thr172的接近，來抑制Thr172的後續磷酸化，並且表示下調AMPK信號傳導的拮抗機制。

    Yvonne Oligschläger（馬斯特里赫特大學）提供新的見解，通過自磷酸化Thr148在β亞基的CBM內的糖原結合AMPK的調節。發現Thr148磷酸化抑制AMPK的糖原定位，從而影響細胞糖原轉換。

    林海成（廈門大學）提出了一個新的機制，其中AMP調節AMPK激活。響應於飢餓或外源AMP，AMP結合觸發肉荳蔻醯化AMPK之間的相互作用，和支架蛋白AXIN其也結合LKB1。值得注意的是，ADP對基於AXIN的複合物形成沒有影響。AXIN-AMPK-LKB1複合物的形成促進LKB1對AMPK的磷酸化，並引起AMPK活化。在隨訪研究中，證明這種機制發生在晚期內體/溶酶體表面，並且依賴於v-ATPase-Ragulator複合物。有趣的是，已知v-ATP酶和Ragulator蛋白是在營養豐富的條件下，募集和激活雷帕黴素複合物1（mTORC1）到溶酶體的機制靶的重要組分。這些結果表明晚期內體/溶酶體在通過AMPK和mTORC1信號傳導途徑，感測營養物中的一般作用，從而提供分解代謝和合成代謝之間的轉換。討論了AMPK在晚期內體/溶酶體蛋白複合物v-ATP酶/ Ragulator對AMPK和mTORC1信號通路之間的反向關係的功能後果。

    為了在AMPK激活的調節中添加另一層複雜性，布魯斯·坎普（聖文森特醫學研究所和墨爾本大學）提供了獨立於Thr172磷酸化的天然AMPK激活的證據。發現小分子AMPK激活劑A769662活化在Thr172上不磷酸化的AMPK。與腺嘌呤核苷酸相反，A-769662不結合γ亞基，但需要β亞基並且其在CBM內的Ser108處自磷酸化以變構地激活AMPK。有趣的是，發現與A-769662和AMP的組合的協同AMPK活化，獨立於α亞基Thr172和β亞基Ser108磷酸化。這些發現提出了基於AMP和小分子激活劑的組合策略，可能與基於AMPK的治療在疾病為中心的研究相關，激進的可能性，進一步的研究是熱切期待。

    在過去幾年中，通過哺乳動物AMPK晶體結構的可用性獲得的知識，從根本上提高了對腺嘌呤核苷酸調節AMPK活性的機制的理解。AMPK複合物的結構信息，也可以幫助設計用於臨床應用的特異性小分子激活劑。與AMP結合的AMP的晶體結構，揭示了γ亞基內的四個潛在的核苷酸結合位點中，只有三個有助於核苷酸調節。使用AMPK在溶液中的結合研究揭示兩個位點（位點1和3），通過AMP，ADP或ATP競爭性結合。相比之下，作為位點4結合的核苷酸是不可交換的。位點2未被佔據，可能是因為該位點缺少在與結合的核苷酸的核糖環相互作用的其它位點中發現的天冬氨酸殘基。在位點1的AMP的結合被分配對變構激活的影響，而AMP或ADP在位點3的結合被分配到去磷酸化的保護。

一個重要的突破來自AMPK調控核心片段的晶體結構，和α亞基的激酶結構域，提供關於由腺苷核苷酸的結合，和不同亞基之間的通信的動力學誘導的構象變化的見解。來自α亞基（α-RIM /α-hook）的柔性組分與γ亞基上的可交換核苷酸結合位點3相互作用，並且有利於Thr172與α和β亞基的C-末端區域相互作用的構象變化，提供抗去磷酸化的保護。

史蒂夫布林（弗朗西斯·克里克研究所）提出了基於全長人類AMPKα2β1γ1異源三聚體，與小分子激活物991和A-769662的複合物結構研究的結果。這兩種化合物的分子機制非常相似，因為它們結合到位於激酶結構域和β亞基的CBM的界面處的相同位點。991和A-769662的結合穩定了CBM和激酶結構域之間的相互作用，其繼而對激活環結構的相互作用具有穩定作用，增強了對T172的去磷酸化的保護。

除了X射線晶體學數據之外，Matt Sanders（The Francis Crick Institute）提出了來自生物物理方法（圓二色性和生物層干擾）的結果，以比較小分子活化劑與AMPK複合物的結合，顯示化合物991顯著更緊密地結合α2/ α1β1γ1和α1β2γ1異源三聚體比A-769662。拉維Kurumbail（輝瑞）描述了基於具有一系列相關的A-769662配位體的結合的全長α2β1γ1異源的晶體結構相似的分子機制。A-769662及其類似物結合在CBM和激酶結構域之間的新的變構袋，並且主要通過降低受質肽的Km來介導它們的作用。

相比之下，AMP已報導了不同的分子機制，AMP通過增加磷酸化反應的V_max來調節AMPK。Uwe Schlattner（INSERM和大學格勒諾布爾阿爾卑斯）提出了結構研究的補充方法，以了解CBS域對變構AMPK激活的作用。他開發了基於核苷酸誘導構象開關模型的AMPK FRET傳感器。該分子傳感器允許在配體結合時，直接和實時讀出AMPK構象變化，並且可以用於各種分析應用，以及用於篩选和體內應用的通用工具。

三、由AMPK在外周和中樞調節的能量平衡

    雖然AMPK最初被確定為細胞能量狀態的傳感器，通過協調合成代謝和分解代謝途徑，來平衡營養供應與能量需求，現在顯然它也通過整合來自細胞環境的信號，參與全身能量穩態的控制和整個生物體。有許多激素參與調節全身能量平衡，改變AMPK激活。Takashi Kadowaki（東京大學）討論了AMPK在介導脂連蛋白的抗糖尿病和抗動脈粥樣化作用中的作用，所述脂連蛋白(adiponectin)是來自脂肪組織的，並且在肥胖相關疾病中減少的激素。脂聯素通過結合脂聯素受體AdipoR1和AdipoR2發揮其作用，AdipoR1和AdipoR2介導增加AMPK和過氧化物酶體增殖物激活受體（PPAR）-α活性，以調節正常的葡萄糖和脂質代謝和胰島素敏感性。他報導了一種口服活性小分子AdipoR1 / R2激動劑（稱為AdipoRon）的鑑定，其對肌肉和肝臟中的脂聯素具有非常相似的作用，在肥胖糖尿病小鼠中激活AMPK和PPAR-α途徑，並改善胰島素阻抗和葡萄糖不耐受在高脂飲食。

    用於調節全身能量平衡的另一層信號積分，發生在通過控制飼餵和能量消耗起作用的下丘腦AMPK水平。MiguelLópez（Universidade de Santiago de Compostella）進一步強調了，AMPK在下丘腦腹內側核的作用，作為外周信號的中樞積分和介導甲狀腺激素，骨形態發生蛋白8B（BMP8B），尼古丁(nicotine)和雌二醇(oestradiol)的影響關於外週代謝，特別是褐色脂肪組織產熱的調節。

四、調查新興AMPK信號途徑

    AMPK調節多種生理事件，並且一致地，預期對生物體水平的存活，生長和發育具有巨大的影響。此外，AMPK的代謝控制的損傷與病理學背景，以及許多流行的人類疾病，包括2型糖尿病，胰島素阻抗，心血管疾病和癌症相關。為了更深入地探討由AMPK控制的各種信號通路，許多團體已經生成和分析各種動物模型，從囓齒動物到蠕蟲線蟲。Pascal Froment（INRA）談到AMPK在雄性和雌性繁殖中的作用。缺乏AMPKα1的雄性小鼠由於結構異常和精子運動性的改變而顯示出生育力下降。來自Sertoli細胞中AMPKα1缺陷的小鼠的結果，證實AMPK對Sertoli-germ細胞相互作用和精子頭部形狀的重要性。在卵母細胞AMPKα1的缺失，也揭示了AMPK對卵母細胞的質量和卵母細胞/體細胞通信的角色。理查德·羅伊（麥吉爾大學）用線蟲來演示， AMPK如何協調生殖幹細胞分裂的啟動與環境條件。在營養/能量壓力期間，AMPK需要緩衝這些細胞中的不良後生過程，最終在隨後的無應變代中導致生殖缺陷。

    Ian Salt（格拉斯哥大學）專注於AMPK在脂肪組織中的作用，不僅影響脂肪細胞中的代謝，還影響抑制促炎症信號途徑。他還討論了血管周圍脂肪組織（PVAT）在心血管疾病的病理生理學中的重要性，以及PVAT中AMPK的失調如何影響肥胖症的血管功能。同樣，Neil Ruderman（波士頓大學醫學中心）描述了來自胰島素抗性患者的多個脂肪組織貯庫中AMPK活性降低。這與氧化應激，炎症細胞因子的表達增加和內臟脂肪中表達氧化磷酸化基因的減少有關。相比之下，在肥胖後手術中觀察到的胰島素敏感性的顯著增加，伴隨著AMPK活性的顯著增加，和皮下脂肪中的氧化應激的減少。

    AMPK已經成為適應環境線索的關鍵調解者。Mark Evans（愛丁堡大學）提供了AMPK對缺氧期間通氣調節的貢獻的遺傳證據，缺乏AMPK的小鼠表現出低通氣和呼吸暫停而不是過度通氣。因此，AMPK信號傳導在全身水平上將氧氣連接到能量供應。RémiMounier（CNRS和大學Claude Bernard Lyon1）談到了在出生後骨骼肌再生過程中幹細胞命運的調節。響應於肌肉損傷，肌肉幹細胞（也稱為衛星細胞）變得活化並觸發導致增殖，分化和/或自我更新的細胞重編程。通過使用刪除的AMPKα1衛星細胞中的小鼠，他表明AMPK編排肌肉幹細胞命運通過促進代謝重編程。

五、癌症中的AMPK：朋友還是敵人？

    十多年前，發現腫瘤抑制基因LKB1作為AMPK的上游激酶，在能量代謝和癌症的調節之間建立了直接的聯繫。然而，累積的數據表明AMPK在癌症發生和進展中的功能作用比預期復雜得多。一方面，AMPK可以介導LKB1的腫瘤抑制信號傳導，並且是抗腫瘤的；另一方面，AMPK是在諸如缺氧和葡萄糖剝奪的代謝應激下的癌細胞存活所需的，並且是突發的。因此，根據上下文，AMPK在癌發生中具有雙重作用。Almut舒爾茨（Universität大學維爾茨）提醒參與者，癌細胞在轉化期間經歷獨特的代謝重編程，並且許多致癌信號通路直接調節代謝過程的活性以支持無限制細胞生長。RosaSeñaris（Universidade de Santiago de Compostella）討論了AMPK參與星形膠質瘤的起始和進展。她證實AMPK在表達致癌HRasV12星形膠質細胞，發現組成性活化，並有助於通過增加細胞外脂質內在化，並通過的脂肪酸從頭合成的抑制，減少能量消耗協調支持高細胞分裂速率。相反，Tracey Rouault（NIH）提供了一個例子，其中AMPK在由富馬酸水合酶（FH）缺乏引起的遺傳性腎癌中起腫瘤抑制因子的作用。降低AMPK的活性通過促進脂質合成和合成代謝反應，有助於FH缺陷細胞的致癌生長。沿著同一條線，羅素瓊斯（麥克吉爾大學）證明AMPK可以作為腫瘤抑制劑在Myc依賴性淋巴瘤。AMPK信號的中斷促進癌細胞的代謝重編程，其中缺氧誘導因子-1α（HIF-1α）的穩定化驅動Warburg效應。在這種情況下，他提出證據支持AMPK在控制粒線體OXPHOS和ROS生產中的作用。Dave Carling（MRC臨床科學中心）討論了AMPK級聯在前列腺癌進展中的作用，並提出前列腺癌細胞中AMPK的活化增加細胞遷移的證據。

    Annapoorni Rangarajan（印度科學研究所）提出了一個新的作用，AMPK在收購anoikis抵抗，實體腫瘤的標誌。通過磷酸化抗凋亡蛋白PEA15，AMPK有助於乳腺癌細胞的錨地依賴性生長。她引起了令人興奮的可能性，針對AMPK-PEA15軸可能會防止乳腺癌的傳播和轉移。Masahisa Jinushi（北海道大學）對巨噬細胞介導的腫瘤細胞吞噬作用，和調節腫瘤免疫監視的分子機制感興趣。他描述AMPKα1與T細胞免疫球蛋白和粘蛋白結構域的分子-4（TIM-4）參與自噬過程的激活，這對於降解攝入的腫瘤及其相關抗原至關重要。這些結果表明靶向TIM-4-AMPKα1相互作用，可以構成增強抗腫瘤免疫和改善癌症化療的獨特策略。

六、新型監管機制在心臟和骨骼肌肉代謝

    在過去十年中，AMPK已經成為調節心肌代謝以應對缺血，壓力超負荷和心力衰竭的關鍵角色。Lawrence Young（Yale）討論了局部缺血/再灌注後粒線體功能的AMPK調節。他還談到的D-多巴色素互變異構酶的治療潛力（DDT），這是一種來自心肌細胞的新型分泌蛋白，其具有重要的自分泌/旁分泌作用，用於在缺血期間預防心臟損傷。有趣的是，DDT的心臟保護作用需要通過鈣依賴性，能量無關的機制牽連CaMKKβ作為主要上游激酶的下游AMPK激活。除了在心肌缺血期間的這種保護作用，AMPK活化還限制心肌細胞肥大的發展，並且增加心肌細胞對胰島素的反應。Luc Bertrand（Louvain天主教大學）描述了涉及其胰島素敏化和抗高血壓作用的新的分子機制和AMPK下游靶標。桑德琳Horman（魯汶天主教大學）提供證據表明AMPKα1在心臟成纖維細胞/成肌纖維細胞生物學中發揮關鍵作用，提供新的視角和潛在的治療方法，可以對抗心肌梗死心臟的不利左心室重塑。

    Erik Richter和Jorgen Wojtaszewski（哥本哈根大學）提醒我們AMPK在骨骼肌代謝中對運動反應的重要作用，就葡萄糖攝取和脂肪酸氧化而言。埃里克里克特探索AMPK和Ca²⁺在肌肉收縮期間增加葡萄糖攝取的相對作用，並且證明了AMPK和Rac1依賴性重排的肌動蛋白細胞骨架的代謝活化，而不是從肌質網釋放的Ca²⁺完全解釋收縮誘導的肌肉葡萄糖轉運。約根Wojtaszewski強調了人類運動期間纖維類型特異性表達和AMPK調節的差異。他還討論了AMPK在運動過程中脂肪酸氧化的重要性，並提供證據支持AMPK的活化足以增加骨骼肌胰島素敏感性的證據。

七、邁向新的AMPK激活劑和治療應用

    許多研究者和主要製藥公司已經將AMPK鑑定為糖尿病，肥胖症，缺血性心臟病，動脈粥樣硬化和癌症領域的藥物開發的潛在靶標。與快速的科學發現同時，製藥公司正在開發特異性，直接作用的AMPK激動劑，其對臨床前轉譯研究和早期臨床研究進展至關重要。馬克騎士（德迪夫研究所魯汶天主教大學）專注於小分子AMPK激活991對骨骼肌葡萄糖攝取的作用。大鼠上皮肌的孵育劑量依賴性地增加含有α1，α2，β1或β2亞基的各種組合的AMPK複合物的活性。重要的是，該工作揭示化合物991以AMPK依賴性方式增加葡萄糖攝取。JérômeTamburini（Inserm，CNRS和UniversitéParis Descartes）使用了一種新的AMPK激活劑GSK621作為急性骨髓性白血病（AML）的治療劑。而出乎意料的是，mTORC1活性與GSK621誘導的細胞毒性的程度相關，並且限定了利用AMPK活化的合成致死機制。值得注意的是GSK621對正常CD34 ⁺造血祖細胞沒有影響，增加了對AMPK活化劑作為AML中有希望的治療分子的發展的支持。Benoit Viollet（Inserm，CNRS和UniversitéParis Descartes）定義了間接和直接AMPK激活劑，對肝臟代謝的AMPK依賴性和獨立代謝作用。使用在肝臟中缺乏AMPKα1/α2催化亞基表達的小鼠，確定AMPK對於二甲雙胍和AICAR介導的原代肝細胞中葡萄糖產生的抑制，和AICAR誘導的體內葡萄糖水平的降低是不必要的。相反，這些藥物以及小分子AMPK激活劑A-769662和化合物-13，在不存在肝AMPK的情況下，在抑制脂質生成中無效。Angela Woods（MRC臨床科學中心）使用新的遺傳模型來提供數據，用於確定AMPK在體內的活化效果。在肝臟中，突變體γ1亞基的表達導致AMPK的基礎活性增加，但令人驚訝地沒有降低餵養正常或高脂肪飲食的小鼠的脂質水平。Greg Steinberg（McMaster University）研究了二甲雙胍聯合水楊酸對肝臟代謝的功能影響。兩種藥物協同激活AMPK，並且大大增強了在鼠和人類肝細胞中脂肪生成的抑制。此外，低劑量二甲雙胍和水楊酸鹽聯合治療，協同減少脂肪肝和增強胰島素敏感性的小鼠餵養高脂肪飲食。這些結果加強了這樣的觀點，即組合治療將有助於增強AMPK活化，並有助於降低施用於患者的單獨藥物的濃度。

八、整合LKB1和AMPK相關激酶的代謝調節

    LKB1是主要的激酶，其磷酸化和活化AMPK以及12種密切相關的蛋白激酶的家族，包括SIK（鹽誘導的激酶），MARK（微管親和力調節激酶）和BRSK（腦特異性激酶）。目前討論的問題是AMPK和AMPK相關蛋白激酶，在介導LKB1對代謝的下游作用的精確作用。在此背景下，箕坂本（雀巢健康科學研究所）通過調節下游轉錄因子/共激活因子，討論了SIK家族成員在LKB1介導的肝葡萄糖異生基因轉錄抑制中的關鍵作用。這些發現支持一種模型，其中LKB1-SIK而不是LKB1-AMPK途徑，在肝臟中作為關鍵的葡萄糖代謝網守起作用。Robert Screaton（東安大略兒童醫院研究所）觀察了SIK2在胰腺β細胞中的功能和葡萄醣體內平衡的控制。通過使用在成人β細胞SIK2缺陷型小鼠，發現SIK2需要葡萄糖誘導的胰島素分泌，並且是在高血糖的模型自適應β細胞功能補償必要的。SIK2磷酸化細胞週期蛋白依賴性激酶5激活劑1CDK5R1 / p35，以引發其通過E3連接酶PJA2的泛素化，導致鈣信號傳導和胰島素分泌的激活。值得注意的是，SIK2在調節胰島素分泌中具有特異性作用，因為沈默SIK1或SIK3在這方面沒有作用。OlgaGöransson（隆德大學）也強調了SIK2在調節代謝過程中的重要性。她顯示來自原代脂肪細胞的數據，證明SIK2在調節GLUT4水平和葡萄糖攝取中的作用，潛在地通過其對CREB調節的轉錄共激活子（CRTC）和組蛋白脫乙醯酶（HDAC）4的作用。Kristopher Clark（Dundee大學）討論了靶向SIK治療慢性炎性疾病的治療潛力。以前的工作顯示用pan-SIK抑制劑HG-9-91-01，對SIK的抑制提高了抗炎細胞因子的產生，同時抑制巨噬細胞中促炎細胞因子的產生。他描述了SIKs作為抗癌藥物波舒替尼(bosutinib)和達沙替尼(dasatinib)，介導這些藥物的先天免疫系統的影響的主要目標。他建議重新使用這些治療劑治療慢性炎症性疾病。

    Guy Rutter（倫敦帝國學院）研究了LKB1和AMPK在β細胞同一性的控制中各自的作用。在這種情況下，雖然LKB1和AMPK信號僅部分重疊，以保持β細胞的身份，它們通過抑制肝和神經元基因的不同亞型的表達來起作用。Biplab Dasgupta（辛辛那提兒童醫院醫學中心）提出了LKB1和AMPK在調節細胞代謝中的不同作用的實例。他發現LKB1是施旺細胞(Schwann cells)分化期間代謝重編程（從糖酵解到氧化代謝）的關鍵參與者，而AMPK是很大程度上不必要的。雪旺氏細胞(Schwann cells) 缺乏LKB1不能產生線粒體Krebs循環底物檸檬酸，細胞脂質的前體，導致受損的發育髓鞘形成和軸索完整性。為了鑑定AMPK及其相關家族成員的另外的新靶標，Reuben Shaw（The Salk Institute for Biological Studies）提出了一種使用體內定量蛋白質組學分析的策略，其通過具有重氮穩定同位素的蛋白質的代謝標記。正在進行的工作涉及在二甲雙胍治療的野生型中的磷酸蛋白與缺乏LKB1的小鼠的鑑定和表徵。

九、結語

    對於在AMPK調控機制的理解和我們目前對AMPK控制的新下游靶標和信號通路的了解，考慮到這些發現的重要性和提出的新問題，預計下一次關於AMPK和AMPK相關蛋白激酶的會議將是同樣令人興奮的。在該領域中的剩餘挑戰，包括將基本研究轉化為治療方法和治療劑的開發，例如同種型特異性小分子AMPK激活劑。